實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

親和層析法純化的二抗

用親和層析法純化的抗體是指，利用耦聯(lián)到瓊脂糖凝膠上的抗原將抗血清中的抗體親和層析下來。我們采用一種*的連續(xù)的洗脫過程將抗體從固態(tài)抗原上分離出來。我們提供的未標(biāo)記的親和層析法純化的抗體是不含有穩(wěn)定劑和防腐劑的無菌液體。耦聯(lián)標(biāo)記物的抗體是凍干粉，里面含有穩(wěn)定劑和防腐劑，但是過氧化物酶標(biāo)記的抗體里面不含防腐劑。  

親和層析純化抗體的選擇和定位

*步： 選擇 Whole IgG 、 F(ab ’)2 片段，或者 Fab 片段抗體。 
我們提供三種親和純化的二抗： Whole IgG ， F(ab ’)2 片段， Fab 片段。  

Whole IgG 抗體是從抗血清中分離出來的完整的分子。這些抗體有一個 Fc 部分和兩個與抗原結(jié)合的 Fab 部分，因此是二價的（圖 1 ）。它的平均分子量約為 160KD ， Whole IgG 抗體適用于多數(shù)情況，也是的。

F(ab ’)2 片段   抗體是用胃蛋白酶消化 IgG 去除 Fc 部分，剩下兩個靠二硫鍵連接的結(jié)合抗原的 Fab 部分，依然是二價的。（圖 1 ）這抗體用在特定的情況中，例如避免抗體與 Protain A 或 G 結(jié)合，或者與有 Fc 受體的活細胞結(jié)合。但是，如果一抗是 whole IgG ，不管二抗是哪種形式都可能出現(xiàn)結(jié)合 Fc 受體。這時，為了阻止抗體結(jié)合到 Fc 受體上，可以在 4 度將細胞預(yù)培養(yǎng)于含有疊氮鈉和二抗來源物種正常血清的緩沖液中。

注意：當(dāng)使用的是帶標(biāo)記的二抗時，千萬不能用一抗來源物種的正常血清和 IgG 來封閉。如果血清中的免疫球蛋白非特異性的結(jié)合到樣品上，他們會被帶有標(biāo)記的二抗識別，導(dǎo)致背景過高。

牛血清白蛋白（ BSA ）和奶粉是zui為常用的封閉液，它們可能含有 IgG, 除了?？寡?/span> IgG 外，許多二抗如抗牛，抗山羊，抗綿羊與牛 IgG 有較強的反應(yīng)。因此，使用 BSA 或奶粉封閉或稀釋抗體會增加背景或降低抗體效價。推薦用來自二抗的物種的正常血清（ 5% v/v ）封閉。

 Fab 片段   抗體是用木瓜蛋白酶消化 IgG 后得到的。這些抗體只含有一個結(jié)合位點（圖 1 ）。它們用來封閉內(nèi)源性的免疫球蛋白，或者在使用相同物種來源的一抗作多標(biāo)記的實驗中，用于封閉暴露的免疫球蛋白。而二價的抗體（ whole IgG 或 F （ ab’ ） 2 片段）不能用來封閉，因為它們有二個結(jié)合位點。封閉后，一些結(jié)合位點可能為暴露出來，與一抗結(jié)合，從而導(dǎo)致高的背景或假陽性標(biāo)記。

第二步： 在左邊標(biāo)記“ antibody description ”的攔里找到一抗的物種來源。

抗體是根據(jù)一抗的物種來源的字母表順序排列。比如，如果一抗是小鼠來源的，就找“ anti-mouse ”。

說明：目錄中提供了抗敘利亞倉鼠和抗亞美尼亞倉鼠的抗體。為了正確的選擇二抗，必須知道一抗是在哪種倉鼠中制備的。

第三步： 在標(biāo)有“ Host ”這一欄中選擇二抗的物種來源。

二抗的物種來源在抗體描述的開始部分，選擇二抗的物種來源應(yīng)考慮幾點: 1) 個人的取向或經(jīng)驗。 二抗的質(zhì)量問題與物種特異性沒有關(guān)系。2 ）與蛋白A 和蛋白G 結(jié)合。兔抗體能很好地與蛋白A 和蛋白G 結(jié)合，但羊和猴抗體能更好的與蛋白G結(jié)合。 3 ）經(jīng)物種吸附處理的抗體可用性。某些物種來源的抗體可能不能被具有交叉反應(yīng)的物種進行吸附處理。選擇經(jīng)過吸附處理的物種。4 ）物種兼容性。 在多標(biāo)記實驗中，一些物種不能和其他物種兼容。一般地，多標(biāo)記二抗必須來自同一物種。

第四步： 在“ antibody description ” 下面選擇二抗的特異性。

下面詞語的解釋將對選擇合適的抗體有所幫助。

注意：不同來源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu)，抗體的生成過程也相似?？挂粋€物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)， 除非特異性的經(jīng)過交叉反應(yīng)物種的吸附處理。在抗體描述中，經(jīng)過其他物種的吸附處理的抗體標(biāo)有“ (min X …Sr Prot) ”字樣 。

Anti-IgG (H+L)

這類抗體和 IgG 分子的重鏈和輕鏈都可以反應(yīng)，比如，和 IgG 分子的 Fc ， F(ab ’)2/Fab 部分。 Anti-IgG (H+L) 抗體也可以和其他的免疫球蛋白家族（ IgM ， IgA ，IgD,IgE ）和亞家族反應(yīng)，因為所有的免疫球蛋白都有相同的輕鏈（或者 κ 鏈，或者 λ 鏈）。 Anti-IgG (H+L) 抗體比只抗片段的抗體識別更多的抗原表位，適合普通的免疫檢查過程。

Anti-IgG ， Fc/ Fc γ fragment specific

這類抗體和 IgG 重鏈的 Fc 部分反應(yīng)。它們通過 ELISA 檢測，和 / 或針對 Fab 片段吸附測試。某些情況下，這類抗體需要額外檢測和 / 或吸收處理來降低 IgM 和 或 IgA 的交叉反應(yīng)。在這種情況下（ 抗人，抗鼠和抗大鼠 ），抗體標(biāo)有“抗IgG （ Fc γ ）”，表示這類抗體只與 IgG 重鏈反應(yīng)，通常不能和 IgA 或 IgM 任何表位反應(yīng)。

注意：不是所有 anti-IgG, Fc 抗體和所有亞型的 IgG 反應(yīng)能力一致。要找和四種 IgG 亞類反應(yīng)能力差不多的 抗鼠IgG, Fc γ抗體的話，應(yīng)當(dāng)選羊抗鼠IgG( 亞類1+2a +2b+3), Fc γ特異性片段(min X Hu,Bov,Rb Sr Prot) 。

Anti-IgG ， F(ab ’)2 fragment specific

這類抗體和 IgG 的 F(ab ’)2/Fab 部分反應(yīng)。它們經(jīng)過了 ELISA 和 / 或 Fc 片段的吸附檢測。它們不是特異性 IgG ，因為它們是和輕鏈反應(yīng)的，它們同時也和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白（ Ig D, IgM, IgA 和IgE ）和亞類反應(yīng)。

(min X …Sr Prot)

與一個物種反應(yīng)的二抗可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)，除非這類抗體經(jīng)過其他物種的吸收實驗。這類抗體經(jīng)過了檢測，以及針對 IgG 和圓括號中的物種的血清蛋白的吸附處理。 （標(biāo)有“ (min X…Prot)” 字樣的抗體是經(jīng)過了圓括號中所標(biāo)的物種的 IgG 和 / 或血清蛋白的吸附處理的）。當(dāng)其他物種免疫球蛋白的出現(xiàn)可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)時，推薦使用這類抗體。但是，當(dāng)要選擇經(jīng)過針對相近物種吸附處理的抗體時，要特別注意，因為它們能識別的表位數(shù)量大大減小了，可能識別單抗的能力很弱。例如，在含有內(nèi)源性免疫球蛋白的大鼠的組織樣本中，只用經(jīng)大鼠 IgG 吸附處理的抗鼠 IgG 檢測大鼠組織中的鼠源一抗，或者在多標(biāo)記實驗中使用了大鼠的一抗。另個一個例子是抗大鼠 IgG(min X Mouse… Sr Prot) 和抗敘利亞倉鼠 IgG （ min X….Mouse, Rat Sr Prot ）。

實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

以下是圓括號中所使用的一些簡稱：

Bov = Bovine
      Ck = Chicken
      Gt = Goat
      GP = Guinea Pig
      Sy Hms = Syrian Hamster
      Hrs = Horse
      Hu = Human
      Ms = Mouse
      Rb = Rabbit
      Shp = Sheep
      Sw = Swine
      Sr = Serum
      Prot = Protein.

ML （ Multiple Labeling ）

有些抗體標(biāo)明了“ ML ” ，來強調(diào)它們除了可以用于單標(biāo)，還可用于多標(biāo)記實驗。

抗亞美尼亞倉鼠IgG 和抗敘利亞倉鼠IgG

大部分倉鼠單克隆抗體是來原于亞美尼亞倉鼠的脾臟細胞和鼠骨髓瘤細胞的雜交瘤細胞，它是亞美尼亞（而不是敘利亞）倉鼠IgG. 許多商業(yè)化的多克隆抗倉鼠IgG 是抗敘利亞倉鼠IgG, 這種抗體在檢測亞美尼亞倉鼠IgG 單克隆抗體時，它的效果沒有抗亞美尼亞倉鼠IgG 好。

注意：抗亞美尼亞倉鼠IgG(H+L)(min X Bov, Hu, Ms , Rb, Rat Sr Prot) 不能識別所有的亞美尼亞倉鼠單克隆抗體，因為它經(jīng)相近物種的吸附處理過（粗體字）。因此，使用經(jīng)過少數(shù)物種或少數(shù)相近物種的吸附處理過的抗體可達到較好的效果，如抗亞美尼亞倉鼠IgG(H+L)(min X BoV Sr Prot), 除此之外，在小鼠或大鼠免疫球蛋白中也應(yīng)該檢測亞美尼亞倉鼠單抗。

第五步： 從表格頂部選擇需要的探針。

關(guān)于探針的技術(shù)信息參考其他網(wǎng)頁。

第六步： 在 antibody description 一行和探針欄相交處，找到選擇的抗體的價錢、規(guī)格和目錄號。

每個方格頂部的數(shù)字是每單位的價錢，底部的 9 位數(shù)字為目錄號。

第七步： 以定購目的查看產(chǎn)品說明

為了避免錯誤，產(chǎn)品說明應(yīng)該遵循一個特定的語法排列。比如，目錄號為 115 － 096 － 072 的產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)描述為：

FITC-conjugated  |	AffiniPure |	F(ab)2 fragment  |	of Goat |	Anti-Mouse  |	IgG, F(ab)2 fragment specific  |
A	B	C	D	E	F
(minimal cross-reactivity to human, bovine, and horse serum proteins)  |
G

A.       耦聯(lián)的探針說明，如熒光素，酶，生物素等。如果抗體沒有耦聯(lián)，不用寫。

B .      抗體純化是商標(biāo)名字，是指從抗血清中通過偶聯(lián)瓊脂糖的抗原免疫層析的方法分離得到的抗體。

C ．抗體的形式－ 完整IgG, 或者 F(ab ’)2 、 Fab 片段。

D.      抗體來源物種名稱。

E ．     和該抗體反應(yīng)的物種名稱。

F.     抗體特異性描述。

G.      經(jīng)過吸附處理以后減小了交叉反應(yīng)的物種名稱。  

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